影響胚胎著床的胚胎因素

　　作者：周 怡，李婷婷，試管方 叢

　　單位：中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，嬰兒因素廣東 廣州

　　本文來源：實(shí)用婦產(chǎn)科雜志 2019 年 2 月第 35 卷第 2 期

　　胚胎著床是成功床胚胎經(jīng)過定位、黏附和侵入種植于子宮內(nèi)膜的率影過程，在人體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射—胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，響胚IVF/ICSI-ET)周期中胚胎著床率約 30%，胚胎反復(fù)著床失敗(recurrent implantation failure，認(rèn)識(shí)ＲIF)的試管發(fā)生率為12%～34%。胚胎因素、嬰兒因素子宮因素、成功床母體免疫異常等原因均可導(dǎo)致胚胎著床失敗。率影胚胎著床成功在臨床實(shí)踐中定義為出現(xiàn)超聲下可見妊娠囊。響胚目前ＲIF尚無統(tǒng)一定義，胚胎最近一篇系統(tǒng)回顧根據(jù)已有研究和專家意見建議定義為:連續(xù)兩次優(yōu)質(zhì)胚胎移植，認(rèn)識(shí)累計(jì)不少于4枚第3天胚胎和2枚囊胚，仍未獲得妊娠［1］。胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能是影響胚胎著床的決定性因素，胚胎染色體異常、透明帶硬化、體外培養(yǎng)環(huán)境不當(dāng)均會(huì)導(dǎo)致胚胎著床失敗。本文將全面闡述影響胚胎著床的胚胎因素及研究進(jìn)展，為從胚胎方面提高著床率提供新思路。

　　1、染色體異常

　　染色體異常是損害胚胎的發(fā)育能力、導(dǎo)致著床失敗的主要原因，自發(fā)性流產(chǎn)中胚胎非整倍體率高達(dá)70%［2］。配子異常和胚胎卵裂異常均可導(dǎo)致染色體異常。Kort等［3］回顧性分析了既往不良妊娠史( 包括復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、非整倍體妊娠、IVF 失敗) 和非醫(yī)學(xué)原因行性別鑒定IVF患者的植入前遺傳學(xué)篩查( preimplan- tation genetic screening，PGS) 結(jié)果，非整倍體數(shù)在有不良妊娠史患者中高，且非年齡依賴。

　　女性＞35歲后懷孕幾率和胚胎著床率明顯下降， 其主要原因是非整倍體卵子增加，胚胎染色體異常發(fā)生率高。Harton 等［2］的一項(xiàng)多中心回顧性分析中，不同年齡組 IVF / ICSI-ET 周期行微陣列比較基因組雜交( comparative genomic hybridization，CGH) ，篩選出整倍體胚胎移植。結(jié)果非整倍體率與年齡呈正相關(guān)，＜ 35歲發(fā)生率為 53. 1%，≥43 歲為 92. 6%。胚胎著床率在＜42 歲的患者中沒有隨年齡改變，≥43 歲的患者則下降。移植整倍體胚胎提高了高齡患者的著床率，這提示胚胎染色體非整倍體性是導(dǎo)致高齡女性著床失敗的重要原因。

　　染色體嵌合體是指在一個(gè)個(gè)體中同時(shí)存在兩種及以上染色體核型的細(xì)胞體系，在胚胎發(fā)育中很常 見，著床前胚胎發(fā)生率為 15% ～ 90%［4］。嵌合體會(huì)影響胚胎的發(fā)育和著床能力，影響程度與染色體異常發(fā)生的時(shí)間、數(shù)量、位置和后續(xù)發(fā)育等因素相關(guān)。在小鼠的嵌合體胚胎模型中發(fā)現(xiàn)嵌合體存在會(huì)導(dǎo)致不良結(jié)局，但隨著胚胎的發(fā)育，非整倍體細(xì)胞比例會(huì)減少，且有足夠數(shù)量正常細(xì)胞的嵌合體胚胎能發(fā)育為健康胚胎。這說明胚胎在發(fā)育過程中有一定的自我選擇和修復(fù)能力，嵌合體存在不一定會(huì)影響胚胎的最終結(jié)局，還需考慮嵌合體數(shù)量、發(fā)生的位置等。Spinella等［5］在一項(xiàng)前瞻性研究中為 77 例患者移植了嵌合體囊胚，根據(jù)嵌合體中非整倍體比例分為低比例嵌合體 (＜50%) 和高比例嵌合體( ＞ 50%) 。研究結(jié)果示低比例嵌合體較高比例嵌合體的胚胎種植率、臨床妊娠率 和活產(chǎn)率高( 分別為 48. 9% vs 24. 2%，40. 9% vs15. 2%，42. 2% vs 15. 2%) 。與移植整倍體囊胚患者比較，高比例嵌合體患者的胚胎種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率均降低( 分別為 24. 4% vs 54. 6%，15. 2% vs46. 4%，15. 2% vs 46. 6%) ，低嵌合體患者則無差異。

　　2 、透明帶因素

　　透明帶在阻止多精受精和維持胚胎完整性方面起重要作用，其異常會(huì)影響胚胎的發(fā)育，導(dǎo)致著床失敗。暗色透明帶( dark zona pellucida，DZP ) 指在光鏡下折光率低、透光性差、顏色暗，DZP會(huì)導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)胚胎形成率、著床和臨床妊娠率下降。既往認(rèn)為透明帶厚度( zona pellucida thickness，ZPT) 及透明帶厚度變化 ( zona pellucida thickness variation，ZPTV) 會(huì)影響胚胎著床率，但 Lewis 等［6］對 768 例第 3 天新鮮移植胚胎的ZPTV 與胚胎著床之間的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) ZPTV 與胚胎著床之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。胚胎孵出是著床過程中的重要環(huán)節(jié)，如透明帶硬化則不能孵出，導(dǎo)致著床失敗。輔助孵化( assisited hatching，AH) 包括機(jī)械法( 部分透明帶切除) 、化學(xué)法、激光法，近年來激光法被廣泛應(yīng)用于臨床，關(guān)于 AH 的作用一直存在爭議。有研究指出AH可以提高ＲIF患者的著床率和臨床妊娠率［7］。但在年齡＜38 歲且 ZPT≥13 μm 婦女中，AH 不能提高胚胎著床率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率［8］。最近的一項(xiàng)系統(tǒng)回顧認(rèn)為［9］，透明帶打薄 AH 對新鮮胚胎移植周期改善臨床結(jié)局作用有限，透明帶打孔 AH 可以提高凍融胚胎移植周期的著床率和臨床妊娠率。

　　3 、胚胎培養(yǎng)

　　良好的培養(yǎng)環(huán)境與技術(shù)是保證胚胎正常發(fā)育的基礎(chǔ)，培養(yǎng)環(huán)境會(huì)直接影響早期胚胎的質(zhì)量，進(jìn)而影響胚胎的著床。培養(yǎng)液是與胚胎直接接觸的環(huán)境，也是胚胎體外發(fā)育唯一的營養(yǎng)來源，其組分、配比、pH值、滲透壓均與胚胎的質(zhì)量密切相關(guān)。現(xiàn)商品化的培養(yǎng)液主要包括序貫培養(yǎng)液和單一培養(yǎng)液。單一培養(yǎng)液有利于囊胚形成，提高囊胚質(zhì)量，但是對臨床結(jié)局兩者無差異［10］。有學(xué)者認(rèn)為胚胎在發(fā)育過程中可產(chǎn)生一些促進(jìn)發(fā)育的因子，將胚胎成組培養(yǎng)可以提高囊胚形成率和著床率。Ebner等［11］將 72 例患者 936 原核期胚胎隨機(jī)分為 3 組，分別為單獨(dú)培養(yǎng)、同一微滴單獨(dú)培養(yǎng)和成組培養(yǎng)( 每微滴 3 ～ 5 個(gè)) ，均培養(yǎng)至囊胚期。結(jié)果成組培養(yǎng)的胚胎有更高的囊胚形成率( 3 組分別為40. 8%、45. 2% 和 55. 8%) ，臨床妊娠率也提高。也有將卵裂期胚胎成組培養(yǎng)至第 3 天，與單獨(dú)培養(yǎng)胚胎相比著床率與妊娠率無差別，但在＜ 35 歲婦女中增加可用囊胚數(shù)［12］。目前各研究中所使用的培養(yǎng)方案不統(tǒng)一，尚需更多重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)其作用。

　　在傳統(tǒng)的培養(yǎng)體系中，評估胚胎發(fā)育情況需將胚胎從培養(yǎng)箱中取出。多次、長時(shí)間的觀察會(huì)引起培養(yǎng)液溫度、pH值等參數(shù)改變，進(jìn)而對胚胎發(fā)育產(chǎn)生不良影響。Time-lapse實(shí)時(shí)觀察系統(tǒng)無需移動(dòng)胚胎就可進(jìn)行觀察評估，避免了對培養(yǎng)環(huán)境的干擾，可提高胚胎質(zhì)量和著床率。Barrie等［13］ 根據(jù)患者年齡、獲卵數(shù)、治療方案和取卵時(shí)間將使用Time-lapse 培養(yǎng)箱和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱的患者配對，通過分析比較得到兩組臨床妊娠率、著床率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( 分別為 44. 8% vs 36. 5%，39. 3% vs 32. 2%) 。但近期的其他研究發(fā)現(xiàn)［14］，Time-lapse 培養(yǎng)體系沒有提高 IVF / ICSI 新鮮周期著床率。該研究未追蹤在試驗(yàn)中冷凍的胚胎結(jié)局，是否能獲得累計(jì)妊娠結(jié)局的提高還需進(jìn)一步探討。

　　4 、胚胎評估

　　篩選出最具發(fā)育潛能的胚胎移植是提高 IVF / IC- SI-ET 成功率的關(guān)鍵，傳統(tǒng)的胚胎形態(tài)學(xué)評估仍是目前最常用、最經(jīng)典的方法。胚胎的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)能反映胚胎質(zhì)量，可以較好預(yù)測胚胎發(fā)育潛能。卵裂期評估低質(zhì)量的胚胎發(fā)育為囊胚幾率降低，其發(fā)育而成的囊胚著床率也下降40%［15］。囊胚期胚胎評分可以反映其著床和繼續(xù)妊娠能力。Irani等［16］ 回顧性分析了417 例凍融整倍體囊胚移植周期，根據(jù)冷凍前評分將胚胎分為質(zhì)量極優(yōu)、優(yōu)質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)和差 4 組，發(fā)現(xiàn)極優(yōu)組和優(yōu)質(zhì)組的妊娠率顯著高于差組( 分別為 84. 2%、61. 8%和 35. 8%) ，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)( inner cell mass，ICM) 評分為 A的胚胎妊娠率高于 B 和 C ( 分別為 76. 2%、53. 6% 和13. 5%) 。滋養(yǎng)層細(xì)胞( trophectoderm，TE) 評分對預(yù)測胚胎發(fā)育潛能更重要。TE 評分為 A、B、C 時(shí)著床率分別為 67%、51%和 25%，活產(chǎn)率為 57%、40% 和 25%，三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且ICM / TE 評分中 BA 著床率優(yōu)于AB 和BB( 分別為 80%和 52%、44%)［17］。

　　形態(tài)學(xué)評分不可避免帶有胚胎學(xué)家主觀因素，且沒有一個(gè)是胚胎質(zhì)量的絕對標(biāo)志，在評分為優(yōu)質(zhì)的胚胎中非整倍體并不少見。Time-lapse實(shí)時(shí)觀察系統(tǒng)可以動(dòng)態(tài)連續(xù)觀察胚胎的發(fā)育情況，觀察到胚胎不正常分裂、碎片出現(xiàn)時(shí)間、囊胚形成時(shí)間等在傳統(tǒng)評估體系中無法獲得的信息，從而提供更多客觀準(zhǔn)確的形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，利于全面評估胚胎的發(fā)育潛能，篩選出最優(yōu)的胚胎，提高著床率。目前其對胚胎的評估價(jià)值和臨床結(jié)局的改善仍有爭議。尋找能夠客觀預(yù)測胚胎發(fā)育潛能的非侵入性指標(biāo)對篩選優(yōu)質(zhì)胚胎，提高著床率和臨床結(jié)局非常重要。

　　5 、胚胎移植選擇策略

　　胚胎移植是 IVF / ICSI-ET 過程中的最后一步，也是影響胚胎著床的關(guān)鍵因素。胚胎移植的時(shí)期、數(shù)目、移植技術(shù)、新鮮或者凍胚移植都會(huì)關(guān)系到著床成功率。在早期受體外培養(yǎng)技術(shù)的限制，多選擇 D2 / D3 胚胎移植。隨著培養(yǎng)技術(shù)的不斷優(yōu)化，越來越多人選擇延長培養(yǎng)至 D5 / D6 囊胚移植。囊胚移植更符合人的生理狀態(tài)，且延長培養(yǎng)能夠淘汰發(fā)育差的胚胎，提高胚胎著床率。相關(guān)研究證實(shí)囊胚移植可以提高患者的著床率和妊娠率，但近期 Levi-Setti 等［18］ 在＜ 39 歲、至少獲 3 個(gè)受精卵和既往少于 4 次 IVF / ICSI-ET 周期史的患者中發(fā)現(xiàn)，新鮮周期中囊胚和卵裂期移植著床率和妊娠率無差異。囊胚移植會(huì)導(dǎo)致可移植和冷凍胚胎數(shù)減少，對于累計(jì)活產(chǎn)率的影響還需進(jìn)一步研究。

　　胚胎冷凍保存技術(shù)取得突破，使每取卵周期的成功率和胚胎利用率極大提高。在 ＲIF 患者中整倍體凍胚移植比鮮胚移植成功率高。移植數(shù)目增加能提高著床率，但多胎妊娠率增加了高危妊娠發(fā)生和孕產(chǎn)婦死亡的概率。我國已規(guī)定每個(gè)移植周期移植胚胎數(shù)不超過 3 個(gè)，35 歲以下婦女第 1 次助孕移植胚胎數(shù)不超過 2 個(gè)。

　　6、其他因素

　　線粒體是為細(xì)胞代謝提供能量的重要場所，當(dāng)胚胎發(fā)育異常時(shí)其能量代謝會(huì)發(fā)生改變，線粒體 DNA ( mitochondrial DNA，mtDNA ) 拷貝數(shù)會(huì)代償性增加。高齡女性、非整倍體和妊娠失敗的胚胎中有較多的mtDNA 拷貝數(shù)，且整倍體胚胎 mtDNA 拷貝數(shù)超過一定水平時(shí)不能著床［19］。mtDNA 拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量和種植潛能相關(guān)，測量 mtDNA 拷貝數(shù)可作為評估胚胎發(fā)育潛能的指標(biāo)。Victor 等［20］則在研究中指出，mtDNA拷貝數(shù)與胚胎整倍體性、年齡、著床能力不相關(guān)，其對胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測價(jià)值有待商榷。

　　此外，胚胎在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的一些物質(zhì)與發(fā)育潛能和著床力相關(guān)，培養(yǎng)液中檢測胚胎基質(zhì)金屬蛋白酶( MMP-9) 、白細(xì)胞介素 8( IL-8) 可用于預(yù)測著床率和妊娠率。緊縮現(xiàn)象指在囊胚形成期間，卵周間隙因滋養(yǎng)層細(xì)胞退縮再次出現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)［21］，緊縮現(xiàn)象的發(fā)生在非整倍體胚胎中高于整倍體，且會(huì)損害整倍體胚胎的著床能力。

　　7、結(jié) 語

　　輔助生殖技術(shù)的不斷進(jìn)步幫助眾多不孕不育夫婦實(shí)現(xiàn)了為人父母的愿望，但胚胎著床失敗仍是解決不孕癥的難題。現(xiàn)胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)日趨完善，冷凍技術(shù)提高了胚胎利用率，篩選出最具發(fā)育潛能的胚胎移植是提高著床率的關(guān)鍵。植入前遺傳學(xué)檢測能夠篩選出染色體異常，Time-lapse實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)能夠提供胚胎發(fā)育過程中客觀的形態(tài)動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。如將兩者結(jié)合起來用于胚胎篩選，既能知道染色體是否正常，又能從形態(tài)學(xué)上更加客觀全面評估，利于篩選出最具發(fā)育潛能的胚胎，提高著床率。因價(jià)格昂貴和缺乏足夠證據(jù)，目前沒有廣泛使用，其應(yīng)用是否利于妊娠結(jié)局還存在眾多爭議，需要進(jìn)一步探討。除此之外，多種動(dòng)力學(xué)、代謝參數(shù)也被提出用于評價(jià)胚胎質(zhì)量，其預(yù)測價(jià)值仍尚需更多研究明確。提高胚胎質(zhì)量和尋找客觀無創(chuàng)的胚胎發(fā)育潛能預(yù)測指標(biāo)，是提高胚胎著床率仍需不斷探索的問題。

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